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实验中较常遇到的问题
穿刺菌用接种环蘸取后划线于含相应抗生素的 LB 平板，37 ℃ 过夜培养，挑单克隆接种液体 LB 摇菌 12–16 h 后提取质粒；或直接接种液体培养基扩增。甘油菌解冻后取少量接种，剩余立即放回 −80 ℃。
如需重新转化，取 40–60 ng 质粒加入 DH5α 感受态细胞，冰浴 30 min，42 ℃ 热激 90 s，冰浴 2 min，加无抗生素 LB 复苏 45–60 min 后涂板。
依次检查：细胞状态与传代次数（建议使用对数生长期、传代 20 代以内）；转染时细胞密度（40%–60% 为宜）；siRNA 终浓度（常用 20–50 nM）；siRNA 与转染试剂的比例；培养基是否含双抗（建议转染时改用无抗生素培养基）；检测时间点（mRNA 水平 24–48 h 检测）。
可用荧光标记 siRNA 作阳性对照，判断问题出在转染步骤还是检测步骤。
常见原因包括：引物二聚体（引物浓度偏高或序列自身互补）、非特异扩增（引物特异性不足）、基因组 DNA 污染、退火温度偏低。
处理方式：降低引物浓度至 200–300 nM、提高退火温度 1–2 ℃、改用跨外显子引物、反转录前做 gDNA 去除处理，并用 2% 琼脂糖凝胶确认扩增产物为单一条带。
无信号：转膜方向或效率异常（可用丽春红染色确认）、一抗与目标物种不匹配、一抗浓度过低、ECL 底物失效、封闭时间过长掩盖抗原。
背景高：封闭不充分（脱脂奶粉建议 5%、室温 1 h）、抗体浓度过高、洗涤次数或时间不足、膜在操作过程中变干、二抗与封闭剂交叉反应（含牛奶时避免使用抗羊二抗）。
不建议。每次冻融滴度会下降，通常 3 次以内可接受，超过则明显衰减。收到病毒液后应在 4 ℃ 缓慢解冻，按单次实验用量分装后存于 −80 ℃，避免反复取出升温。操作时在生物安全柜内进行，废液按生物安全规范处理。